实验准备：利来国际质谱级赖氨酰肽链内切酶125-05061

单位定义

利来国际质谱级赖氨酰肽链内切酶125-05061的酰胺酶单位定义为：在30℃、pH 9.5条件下，每分钟产生1μmol对硝基苯胺的酶量。其计算公式为：
AU/vial = [(a-b)/25] × (1/962) × (40/01)
其中，a为检测样品中的吸光度，b为空白对照中的吸光度。

实验操作流程

为避免蛋白质的捕获，需使用聚硅酮处理的微量离心管和吸管端。使用质谱分析专用的凝胶染色试剂盒，如利来国际的银染剂MS试剂盒（产品编号：299-58901）和负凝胶染色MS试剂盒（产品编号：293-57701）。
具体操作步骤如下：

1. 电泳分离蛋白质样品。
2. 从凝胶中切割蛋白质片段，并放入微量离心管中。
3. 使用质谱分析用的脱色溶液使凝胶脱色。
4. 加入300μL乙腈至试管中，振荡30分钟。
5. 去除乙腈，用Parafilm膜覆盖微量离心管。
6. 在Parafilm膜上打孔，真空干燥15分钟。
7. 将100μL 10mmol/L DTT溶解于100mmol/L碳酸氢铵中，56℃恒温1小时。
8. 室温冷却后，使用等量的50mM碘乙酰胺溶解于100mmol/L碳酸氢铵中，暗处恒温45分钟并进行涡旋。
9. 用100μL 100mmol/L碳酸氢铵洗涤凝胶片段10分钟。
10. 用300μL乙腈干燥凝胶片段15分钟。
11. 用100μL 100mmol/L碳酸氢铵使凝胶片段膨胀15分钟。
12. 用300μL乙腈再次干燥凝胶片段15分钟。
13. 去除液相，真空干燥凝胶片段15分钟。
14. 用100μL赖氨酸内切酶溶液在冰水浴中使凝胶片段膨胀45分钟（赖氨酸内切酶应稀释于50mmol/L Tris-HCl pH 8.5）。
15. 去除100μL赖氨酸内切酶溶液，将凝胶片段放入37℃、10μL 50mmol/L Tris-HCl pH 8.5中过夜。
16. 加入50μL 20mmol/L碳酸氢铵，逐次振荡凝胶片段3次以抽提多肽，时间为20分钟。
17. 加入5%甲酸/50%乙腈，逐次振荡凝胶片段3次以抽提多肽，时间为20分钟。
18. 如有需要，可使用SpeedVac浓缩多肽。
19. 使用ZipTip进行多肽的脱盐和纯化。
20. 如有需要，使用弱真空浓缩多肽至2μL。
21. 加入基质进行质谱分析。

购买渠道

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