一、细胞培养条件

细胞名称：生长特性；贴壁生长；冻存条件。

无血清冻存液。

培养体系

基础培养基为1:1的MCDB105培养基（最终浓度为15g/L碳酸氢钠）与M199培养基（最终浓度为22g/L碳酸氢钠）的混合物，添加15%优质胎牛血清及1%双抗。

传代方法

首次建议以1:2的比例进行传代，传代后2天需更换培养液。

备注：使用无菌离心管收集培养基，作为过渡对比培养。如对比效果不佳，建议直接购买我们的完全培养基。

二、细胞处理

收到细胞后，待其恢复良好状态后，灌入完全培养液并封好瓶口，以确保运输的安全性。

收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，之后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2培养箱静置3-4小时，以稳定细胞状态后进行后续处理。通过显微镜观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（最好40x, 100x, 200x各一张），前三天的照片为售后依据，不提供则默认状态良好。

在传代后，建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基进行对比培养，换液时请将瓶盖稍稍松开。

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

若细胞汇合度未超过80%，请将培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基，放入37℃、5% CO2孵箱中培养；如果细胞密度超过80%，即可进行传代，步骤如下：

弃去上清培养液，用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃孵箱中消化1-2分钟，观察细胞消化情况。若细胞大部分变圆并脱落，迅速轻敲培养瓶后添加5ml以上的完全培养基以终止消化。
轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出悬液，转移至离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清液后补加1-2ml完全培养基重悬。
按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补足新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存

当细胞覆盖培养瓶的80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗细胞一次。
添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，转动培养瓶并观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，转移到15ml离心管中，并在1000rpm下离心5分钟。
弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
将冻存细胞直接放入-80℃冷冻箱中，若后期需转入液氮罐，需在-80℃中存放24小时以上。

细胞复苏：

从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），迅速置入37℃水浴中解冻，直至没有结晶后，用75%酒精擦拭冻存管外壁。将细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟；弃上清后，加入5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，放回37℃、5% CO2细胞培养箱内继续培养。第二天需更换为新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

某些细胞在运输过程中由于不牢固的贴壁状态可能会脱落，这属于正常现象。如脱落的细胞较多，请将培养瓶内的培养液收集至离心管，待后续对比培养，沉淀后加入胰酶进行培养。

五、售后条款

1) 细胞问题可重发的情况：

细胞在运输过程中遭遇的问题，包括丢失、瓶身破损及培养液严重泄漏，均可重发。
若收到细胞48小时内发现污染问题，请及时反馈真实实验结果，经核实后可重发。
常温发货的细胞静置24小时，干冰发货细胞复苏后24小时若多数细胞未存活（需提供真实清晰状态照片），可重发。
若干冰冻存发货的细胞复苏后24小时出现污染，或常温发货的静置4小时后未开封出现污染，均可重发。
如细胞活性存在问题，需在收到产品7天内提交真实实验结果，通过台盼蓝染色法检测细胞活力，核实后可重发。
收到细胞当天及随后的第2、3天需拍照，若超过3天未告知，则视为产品合格。若4-7天内出现问题且提供了前三天的照片和出现问题时的照片，配合技术人员沟通，若判断为我方责任，将免费重发；若双方责任，则协商处理或按合同价的50%收费重发。

2) 细胞问题不予重发的情况：

因客户自己造成的细胞污染，将不予重发。
因客户不当操作导致细胞状态不佳，不予重发。
使用非推荐的细胞培养体系导致细胞状态不佳，不予重发。
细胞状态不佳且未提供培养前三天的照片，不予重发。
细胞培养经历其他处理的情形，不予重发。
在收到细胞后2天内未告知的问题，将不予重发。
根据具体情况而定。

通过利来国际，我们始终致力于为您提供最佳的细胞培养和售后服务，确保您的科研工作顺利进行。