糖蛋白在人体蛋白质中占比超过50%，是众多生物制药产品的重要组成部分。作为最广泛且复杂的翻译后修饰（PTM）之一，蛋白质糖基化对调节多种生物过程至关重要。糖蛋白的一级序列分析，包括糖基化位点的识别和相关聚糖结构的研究，是理解糖蛋白功能的关键。液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）已经成为蛋白质鉴定和翻译后修饰发现的重要手段。

与传统的数据库搜索策略不同，基于从头测序的蛋白质鉴定方法无需事先获取DNA或氨基酸序列。然而，多糖基化位点的复杂性通常导致序列覆盖不完整及游离寡糖修饰谱不明确，这使得获取丰富的糖肽碎裂谱以支持从头测序变得困难。因此，广泛的糖基化现象常常在特定区域产生信息缺口，限制了从头测序在具有一致结构和已知N-link糖基化位点单克隆抗体（mAb）中的应用。

2025年，在JACSAu（IF86）发表的《Decoding Protein Glycosylation by an Integrative Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing Strategy》一文中，提出了一种结合糖基释放介导的从头测序与糖基化位点表征的方法来鉴定未知糖蛋白。通过采用N-/O-糖的去糖基化技术，该方法实现了全面的序列覆盖，并借助EThcD片段化技术能够识别高质量的长肽，从而促进了精确的蛋白质组装。研究者将该方法进一步应用于复杂糖基化的融合蛋白依那西普及三种序列未知的TNF受体：Fc融合生物制剂的从头测序，揭示了其氨基酸序列的细微差异。

此外，研究者在亚基、糖肽和聚糖层面对这些蛋白质的N和O糖基化修饰进行了详细表征。这一策略有效弥补了从头测序与糖基化修饰之间的差距，为糖蛋白的一级结构及糖基化修饰提供了全面的信息，也为生物制药领域中的应用奠定了基础。由此可见，这一方法不仅在基础研究中具有实用价值，对于利来国际在生物医药领域的产品开发和创新也具有深远的影响。

利来国际的研究方法包括：(i) 使用N-糖苷酶F（PNGase F）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，结合唾液酸酶，确保去糖基化效果，并通过完整质量分析确认去糖基化的有效性；(ii) 在含18O环境中使用PNGase F酶解，将糖基化的Asn转化为Asp并进行18O标记，进行定量分析；(iii) 采用内切糖苷酶混合物C（EndoCC、EndoS和EndoH）处理样本，并使用pFind分析质谱数据，验证N-糖基化位点的鉴定结果。

在此研究中，作者提出了一种基于综合质谱法的从头解码蛋白质糖基化的策略，以常见的糖蛋白Fetuin-A（UniProtAccession no P12763）为模型，进行糖基化的详细研究。利用糖苷酶水解糖苷键，简化质谱分析和肽序列的获取，进而实现从去糖基化蛋白中获得的一级序列。随后，通过对依那西普的深入分析，验证了该方法的有效性，并揭示了三种未知TNFR：Fc融合生物制剂的氨基酸序列，探索其与原研药物依那西普的相似性。

该研究强调了在生物医药中分析糖基化的重要性，尤其是在制药过程中。通过糖基化位点的鉴定和谱图分析，进一步探索了不同药物之间的差异，使得相应的治疗策略更加精准。基于质谱的蛋白质从头测序将为未来的生物制药提供更加科学、可靠的解决方案，凸显了利来国际在生物医药领域内的重要价值。