第一章：分子克隆实验概述

分子克隆技术是实验室中广泛应用的一种技术，研究人员可以借助该技术将DNA片段在体外进行重组，构建至载体中。随后，研究者通过转化操作将重组载体导入适合的宿主中以便进行复制和扩增，最终筛选出符合实验要求的载体克隆。

一、分子克隆实验方法

分子克隆研究通常需要将特定的DNA片段插入载体中形成重组质粒。根据不同的实验目的，可以将常见的分子克隆技术分类如下：

• 入门克隆：TA克隆、TOPO克隆。
• 定向克隆：同源重组、酶切连接（黏性末端双酶切反应）。
• 定点突变：碱基的插入、缺失与改变。

1. 酶切连接

酶切连接作为载体构建实验中的重要技术，利用限制性内切酶（主要是Type II型限制性内切酶）和T4 DNA连接酶，实现DNA片段与载体的重组连接。Type II型限制性内切酶能够特异性识别双链DNA序列，并在识别序列内或相邻位置切割，水解核苷酸链中的磷酸二酯键，生成标记的DNA片段（5’端为磷酸，3’端为羟基）。

T4 DNA连接酶则能够催化相邻的5’磷酸基团与3’羟基基团间的磷酸二酯键的形成。构建载体时，首先需分析载体和片段上的酶切位点，确保两者使用相同的限制性内切酶进行消化。然后，通过PCR方法引入对应的酶切位点，进行酶切、纯化并最后连接。虽然此法可实现定向克隆，但有时却因酶切位点的稀缺或切割效率低下而面临挑战。

2. TA克隆

TA克隆指将PCR片段与具有3’-T突出端的载体连接，经过感受态细胞转化等步骤得到重组质粒。此法利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性活性，在双链PCR产物的3’末端添加A碱基。然后和线性化处理的T突出载体进行T/A配对及T4 DNA连接，整个过程快速且高效，但不适用于平末端产物。

3. TOPO克隆

TOPO克隆技术利用拓扑异构酶的催化作用，将目的片段与线性载体连接，并产出重组质粒。拓扑异构酶I具备内切酶和连接酶的双重功能，连接过程迅速，高达80%的反应可在2分钟内完成。该技术允许连接过程中切割DNA链并与3’端的T形成共价键，从而实现快速重组。

4. 同源重组

同源重组指利用重组酶对两段具有相同末端序列的DNA片段进行重组，形成环形双链DNA。要实现此方法，需要事先创建同源区域，通过PCR引物在扩增片段的5’端引入15-20个碱基的外延，从而确保与线性化质粒载体末端序列匹配。该方法高效且不依赖于酶切，可实现便捷的定向克隆。

5. 定点突变

定点突变技术利用PCR方法精确引入所需的碱基变化，包括插入、缺失及替换。传统的定点突变需要一对互补引物并进行PCR扩增，且面临模板需求量大的问题。相对而言，MutExpress点突变系统基于ClonExpress技术，通过部分互补引物的使用，具有更高的成功率，能实现快速、高效的碱基变化改造。

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