当细胞温度降至0°C以下时，会出现脱水现象，细胞内可溶性物质浓度上升，并形成冰晶。冰晶的大小对细胞的影响各异，大型冰晶容易损伤细胞膜和细胞器，导致复苏后的细胞存活率及状态与冷冻前大相径庭。因此，在冷冻细胞时需采取两项重要措施：一是加入低温保护剂，二是进行慢速冷冻。
细胞应在生长状态良好时进行冷冻，理想密度为80-90%，通常细胞数量在10^6-10^7/ml之间。活性较低的细胞在冷冻后能存活的几率较小。
常用的低温保护剂为二甲基亚砜（DMSO），这是一种渗透保护剂，能够迅速进入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点并延缓冷冻过程，使细胞内的水分在冻结前能够排出细胞外，从而在细胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的生成，降低对细胞的损伤。
使用程序控制的降温装置可以实现细胞的慢速冷冻，避免形成大冰晶。如果没有此设备，可以采取逐步降温方式，将细胞在4°C放置1小时、-20°C放置2小时，然后在-80°C过夜，大多数细胞可以适应这一流程。
冷冻液应提前配置并置于室温以备使用，避免临时配置过程中因放热而导致细胞受损。常规的冷冻液比例为培养基：血清：DMSO=7:2:1。如果细胞较为珍贵，可调整为血清：DMSO=9:1。
1. 使用移液器吸去原培养基，加入适量PBS洗涤1-2遍；
2. 进行细胞消化：加入适量胰酶，放入培养箱中于37°C消化（在10厘米大小的平皿中加入1ml 0.25%的胰酶，消化4-5分钟，具体消化时间应根据细胞类型而定，观察到80%-90%以上细胞变圆时终止消化）；
3. 消化完成后，加入2倍体积的完全培养基以终止消化，进行800-1000rpm离心3-5分钟；
4. 准备冷冻管，标记日期、细胞种类、操作者和代数，将离心后的细胞上清液去除，加入冷冻液进行重悬，每管1-1.5ml，然后转移到冷冻管中；
5. 将冷冻管放入程序降温盒中，转至-80°C过夜，随后转移至液氮中保存。
1. 细胞加入冷冻液后应立即放入-80°C进行保存，切勿在常温下放置过久；
2. 在-80°C下，冷冻细胞的储存时间通常不建议超过半年，而在液氮中储存不宜超出2年。
通过以上步骤，使用利来国际的冷冻技术，可以有效提高细胞存活率，确保细胞在冷冻过程中受到最小的损伤，实现高效安全的细胞冷冻保存。
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