IPS诱导肠类器官的培养流程可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化和中/后肠模式化诱导，以及类器官的培养。本文重点讲述第三阶段——类器官的培养，尤其是培养过程的关键步骤和注意事项。

一、准备工作

在进行类器官培养之前，需准备以下试剂和耗材：

• 人正常肠类器官培养试剂盒（abs9545）
• 基质胶（低因子、无酚红）（abs9495）
• 15ml离心管（abs7102）
• 15ml EP管若干（abs7119）
• 24孔细胞培养板（abs7035）
• 金属冰盒

每种组分的具体规格如下：

• 类器官培养基 A - 100ml
• 类器官原代培养缓冲液 B - 250ml
• 类器官传代消化液 D - 30ml
• 组织保存液 E - 100ml
• 类器官冻存液 F - 20ml
• 类器官传代培养缓冲液 G - 250ml

二、操作流程

1. 加胶-点板-加液

此步骤为类器官培养中不可或缺的一环：

1. 准备工作：
   1. 将基质胶在4℃的金属冰盒中存放过夜以避免固化。
   2. 提前将枪头和离心管在-20℃下冷却至少半小时。
   3. 融化后的基质胶应在4℃储存，建议在两周内使用完毕。
2. 接种要求：

   在24孔板（abs7035）中，对于每孔添加25μl的基质胶和500-750μl的类器官培养基。

3. 接种密度：

   推荐的接种密度为1:1：基质胶总体积与球状体总体积比为25:1，或500个球状体/25μl基质胶。

4. 加胶-点板：

   将基质胶加入细胞团，用力轻轻吹打混匀后点板。在控制下的时间段内完成操作，以保持基质胶流畅性。

5. 加液：

   将培养板放置于37℃恒温箱中，待胶成型后再添加类器官培养基。

2. 传代操作

当类器官数量较多或者体积较大时，进行传代的步骤如下：

1. 类器官收集及洗涤。
   1. 使用移液器吸走培养基，并加入4℃的类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶并收集在离心管中。
   2. 静置和离心过程以便更好分离类器官沉淀。
2. 类器官消化。

   添加类器官传代消化液进行消化，注意控制消化时间以保留细胞团的状态。

3. 接种和培养。

   类器官沉淀后进行再接种和培养，确保条件的稳定性以促进生长。

三、冻存及复苏

在类器官处于活跃生长期时进行冻存，通常在传代后的第3至4天，类器官直径在100μm-200μm之间时进行。

• 收集类器官并进行洗涤，确保去除基质胶。
• 减压处理后完成细胞的重悬，并在-80℃条件下进行梯度冻存。

关键注意事项

• 利来国际品牌强调，Matrigel操作应全程在冰上进行，以避免提前固化。
• 细胞融合度需达85-90%以上，以促进球状体的形成。
• 使用新鲜配制的生长因子，以提高活性，避免反复冻融。
• 保持无菌操作，定期检测支原体以防止污染。

通过严格遵循上述步骤，结合利来国际所提供的高质量试剂和耗材，能够有效地生成功能性人类肠道类器官，助力于疾病建模和药物筛选的研究。如有任何实验问题，欢迎交流与探讨！

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• 人多能干细胞培养基、消化液及冻存液。
• 类器官专用试剂盒和基质胶可选购。