通过体外转录（IVT）获得的mRNA，其反应混合物不仅包含所需的mRNA产物，还包括蛋白质成分（如T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶）、NTP、模板DNA、盐离子、各类添加剂及IVT中形成的mRNA副产物（如dsRNA和截断RNA片段）等。这些杂质的存在可能对mRNA的功能产生负面影响，例如影响mRNA的定量准确性、降低翻译效率或改变免疫原性。因此，有必要通过纯化技术将目标mRNA从IVT混合物中分离出来，以确保产品的纯度和完整性，从而保障其安全性和有效性。

常见的mRNA纯化方式包括氯化锂（LiCl）沉淀、硫酸铵沉淀、磁珠纯化、硅胶柱膜纯化及层析纯化等。其中，沉淀、磁珠和硅胶柱法操作相对简单快捷，但纯化效率有限，常应用于科研和早期研发阶段。在工业生产中，层析纯化是主要的纯化方法。

硫酸铵沉淀法的探索

2024年1月，中科院过程工程研究所的张松平团队发表了一篇题为“Rapid and high recovery isolation of mRNA from in vitro transcription system by ammonium sulphate precipitation at room temperature”的文章，探讨了硫酸铵沉淀法用于mRNA纯化的可行性。研究显示，在18M的硫酸铵浓度下，mRNA的沉淀率超过95%，并且在该浓度以上，沉淀速率并未显著提高。此外，溶解率也是一个重要指标，影响最终的mRNA回收率。研究表明，当硫酸铵浓度超过18M时，沉淀物能够在3分钟内迅速溶解在不含RNase的水中，溶解率达90%以上。最佳沉淀条件为2M硫酸铵（AS）、pH 7.0、温度20℃，沉淀时间为2小时，可以实现近100%的沉淀率和溶出率。

硫酸铵与LiCl沉淀法的比较

硫酸铵和LiCl沉淀法对NTP的去除率均超过99%，而DNA模板去除率分别约为82%和85%。硫酸铵沉淀法的去除效率低于LiCl沉淀法，但相较于LiCl，硫酸铵沉淀可以在室温下进行，从而更适合放大生产应用。

硅胶柱膜纯化

硅胶柱膜纯化法基于硅胶膜表面硅醇基团与mRNA分子间的相互作用。硅胶膜在高盐环境下，表面带负电的硅醇基团可以通过形成阳离子桥中和mRNA的表面负电荷，促进其结合。在低盐或水溶液中，由于静电排斥，硅胶膜则会释放mRNA。该方法对蛋白质、多糖等杂质不易吸附，使之能够有效分离mRNA和杂质。同时，硅胶柱膜法所用材料安全无毒，符合环保理念，保护实验人员健康，并减少环境污染。这种方法因高效简便，广泛应用于实验室及早期研发阶段。

工业级纯化及其他方法

当前，在工业级别的mRNA纯化中，通常使用层析法来获取更高的核酸质量。Oligo(dT)亲和色谱较为主流，但其无法有效区分带Poly(A)尾的单链RNA和双链RNA等杂质，因此通常与疏水层析、阴离子层析联合使用以提高纯化精度。这些方法适用于mRNA的放大生产，为客户提供全面的解决方案。

利来国际的mRNA纯化服务

利来国际通过自主开发的平台化mRNA纯化工艺，提供工业级mRNA原液定制化生产服务，并针对不同类型的mRNA及需求，提供专业的mRNA纯化工艺开发服务。在为客户进行工艺开发后，成功将mRNA原液的完整度提升了115%，并将总蛋白残留量降至0.02%。我们还开发了适用于科研和早期研发阶段的mRNA纯化试剂盒，具有操作简便、无须大型设备、工艺时间短等优势。

利来国际致力于为客户提供全套mRNA疫苗及药物相关的高性能酶原料、化学底物、IVT试剂盒及质控试剂盒，拥有自主质粒制备、IVT工艺开发、mRNA纯化及相关质检平台，支持客户快速推进新药开发。同时，对早期研发客户提供CRO服务及各类成品mRNA原液产品，涵盖报告基因、靶点蛋白、基因编辑蛋白及抗原蛋白等。期待与您进一步合作，共同推动生物医疗领域的发展。