免疫沉淀实验是一种在生物医学领域广泛应用的重要技术，用于研究蛋白质间的相互作用和蛋白质的表达状态。根据实验的特定需求，可以选择不同的免疫沉淀方法，其中主要包括磁珠免疫沉淀法和固定免疫沉淀法。

  利来国际推出的磁珠免疫沉淀法利用蛋白A或蛋白G磁珠与特定的抗体结合，以此捕获目标蛋白。这种方法具有操作简便、快速和高效分离的特点，非常适合高通量筛选和自动化实验。磁珠通过磁性分离架进行快速分离，从而使实验步骤更加简化。此外，磁珠免疫沉淀法在研究蛋白质-蛋白质相互作用及信号传导途径时尤为有效。

  相比之下，固定免疫沉淀法则使用固定化抗体（通常为抗体偶联到珠子上）来捕获目标蛋白，常常用于蛋白质印迹法（Western Blot）分析前的样品准备。这一方法需要较长的孵育时间来形成免疫复合物，但因此能够提供更高的特异性和灵敏度，适合定量分析目标蛋白的表达和修饰状态。固定免疫沉淀法在研究蛋白质的表达水平、翻译后修饰及蛋白质稳定性方面至关重要。

  在此之前，我们已经介绍了磁珠免疫沉淀法的具体操作。本节将对此免疫沉淀法进行详细说明，包括所需的试剂与溶液配置：

  1. PBS缓冲液。
  2. 1×细胞裂解缓冲液：包含20mM Tris（pH 7.5）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1% Triton X-100、25mM 焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸酯、1mM Na3VO4及1µg/ml 亮抑酶肽。
  3. 3×SDS样品缓冲液：包含187.5mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C）、6% w/v SDS、30% 甘油、150mM DTT及0.03% w/v 溴酚蓝。
  注：以上溶液均需使用超纯水制备。细胞裂解液在使用前添加1mM PMSF。

  **制备细胞裂解物**
  1. 吸干培养基。根据实验需求，添加含调节因子的鲜培养基，对细胞处理一段时间。
  2. 去除培养基，用冰预冷的PBS洗涤细胞一次。
  3. 去除PBS，每块细胞培养板（10 cm）加入0.5 ml 预冷的1×细胞裂解缓冲液及1mM PMSF。
  4. 将步骤3中的试管置于冰上孵育5分钟。
  5. 轻轻刮下细胞并转移至微量离心管，放置在冰上。
  6. 在冰上对样品超声处理四次，每次5秒。
  7. 在4°C下微量离心10分钟，然后将上清液转移到新的试管中。
  8. 尽快进行后续实验，如不立即进行，需将裂解物储存于-80°C。

  **免疫沉淀法**
  1. 取200μl细胞裂解物，添加10µl固定抗体，置于摇床轻轻摇动，在4°C下孵育过夜。
  2. 4°C下微量离心30秒。
  3. 用500µl的1×细胞裂解缓冲液重悬沉淀物进行清洗，依此离心去除上清，共清洗五次。洗涤过程中保持样品于冰上。
  4. 使用20μl 3×SDS样品缓冲液重悬沉淀物，混匀后微量离心30秒。
  5. 加热样品至95-100°C，保持2-5分钟。
  6. 取15-30µl样品上样至SDS-PAGE凝胶，进行蛋白质印迹实验（请参见蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

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